单核吞噬细胞(MNP)，包括巨噬细胞和树突状细胞，构成了对环境危害和毒性暴露初级反应的重要组成部分。这在哮喘和过敏性气道疾病等疾病条件下尤为重要，因为这些疾病中存在许多不同的细胞类型。在本研究中，我们将CD34+造血干细胞向不同的MNP群体分化，以了解炎症疾病微环境中存在的不同细胞亚型如何对常见过敏原屋尘螨(HDM)作出反应。

scRNAseq ，BD AbSeq，qPCR

‌细胞模型‌：使用人原代骨髓来源的CD34+造血干细胞，通过两种不同方案分化为：

巨噬细胞样细胞(MLC)：使用CSF1、CSF2和TGFβ

树突状细胞样细胞(DLC)：使用FLT3L、CSF2和IL-4

‌暴露处理‌：

HDM(屋尘螨)：25μg/ml

DEP(柴油尾气颗粒)：25μg/ml

联合暴露：HDM+DEP

1. CD34 +造血干细胞培养及髓系分化

为了建立一组人原代髓系细胞，通常在过敏性和非过敏性哮喘条件下发现，我们使用两种方案将CD34 +造血干细胞分化为巨噬细胞样( MLC )或树突状样细胞( DLC ) (图1A )。在形态学上，经过21天的培养，两种细胞群均含有贴壁细胞和非贴壁细胞，表明培养物中存在不同表型的细胞(图1B )。通过全转录组mRNA的单细胞测序，结合寡核苷酸标记的抗体检测细胞表面蛋白(图1C - F)的表达，对这些细胞进行进一步的鉴定。将两种方案中的细胞合并进行分析，每种方案中的细胞类型根据UMAP分离鉴定。

2. 巨噬细胞亚群对尘螨暴露表现出不同的反应

使用MLC培养方案对髓系细胞亚群进行培养，并检测其对单剂量HDM作用24 h的反应。细胞形态(图2A )和毒性(附图S4)无明显变化。检测这些培养物对HDM反应的整体转录变化，发现主要炎症基因如CXCL5和MT1G的变化(图2B )。我们还进行了Scseq分析，以确定巨噬细胞样细胞群(图2C - F)中基因表达的细胞类型特异性变化。对所有细胞的Scseq数据进行差异表达分析，也鉴定出与bulk - seq分析类似的炎症基因表达变化(图2C )。为了检查基因表达的细胞类型特异性变化，使用Seurat KNN分析对Scseq数据进行聚类，使用高度分散的基因(用HDM去除差异调节基因)作为输入。结果以UMAP图显示，每个点代表一个单元格(图2D , E)。这导致了处理在细胞群体中的均匀分布(图2D )。聚类分析(图2E )鉴定出6个主要细胞群体，与图1中鉴定出的亚群体有较近的对应关系。

3.柴油车尾气颗粒物暴露改变了巨噬细胞样细胞中的尘螨反应，部分是通过Nrf2信号驱动的

接下来，我们研究了不同类型的环境吸入危害，DEP如何单独或与HDM暴露结合影响MLC方案分化的细胞。在处理24 h后，DEP单独或与HDM联合诱导了类似的LDH释放增加，表明这些颗粒(附图S4)具有一定的细胞毒性作用。相比之下，HDM并没有显著改变这种反应。细胞对DEP反应的形态学评估显示细胞摄取颗粒，当与HDM联合使用时没有明显差异(图3A )，DEP粒径分布无明显差异。与单独的HDM相比，表达方式和CCL15引起了显著的降低(图3C )。接下来我们检测了去除DEP表面上发现的化学物质对基因e表达方式的影响。与未清洗的DEP相比，用清洗的DEP颗粒( DEP.C )处理可完全降低CYP1B1 e表达方式(图3C )。SLC7A11和NQO1的减少在单独使用清洁颗粒和与HDM ( H + D.C)联合处理时也被观察到。

4. 去除DEP表面的化学物质对基因表达的影响。

在这些处理中观察到的Nrf2依赖性基因表达的变化，使我们进一步使用Nrf2抑制剂ML385来检查这一途径。该小分子与Nrf2的Neh1区域结合，干扰与DNA结合序列结合的蛋白复合物30。MLC方案分化的细胞暴露于HDM & DEP单独或与ML385联合4小时(图4 )，并使用bulk - seq分析检查全局基因表达变化。H + D处理导致大量差异表达基因，其中上调基因多于下调基因(图4A )。大多数上调的基因包括参与炎症过程的基因，包括CXCL5，CXCL8，IL1B和IL19 (图4A )。与ML385共处理导致H + D诱导基因的抑制，包括IL19，CXCL5和CXCL8 (图4B )。通过对不同处理的标准化计数值( RPKM )的可视化来进一步询问选择基因(图4C )。这表明ML385在10 μ M剂量下降低Nrf2依赖的基因表达最显著，表明该通路存在功能性抑制。H + D诱导的炎症趋化因子CXCL5，CXCL8和CCL5的表达也被ML385抑制，最后，我们研究了在DLC方案中分化的树突状样细胞在HDM和DEP处理后是否表现出抗原呈递途径的变化。我们着重以CD40和HLA - DRA的表达变化作为抗原呈递功能的代表性指标。

通过单细胞测序，我们证明巨噬细胞亚型MCSPP1+和MLCMARCO+在HDM刺激后显示出不同的基因表达模式，特别是趋化因子CXCL5、CXCL8、CCL5和CCL15。MLCCD206Hi(替代激活的巨噬细胞)显示出最大的表达变化，而中性粒细胞和单核细胞群体没有反应。进一步的工作研究了污染物柴油机尾气颗粒(DEP)如何改变这些转录反应，并发现CXC型而非CC型趋化因子被进一步上调。通过使用去除吸附材料的柴油颗粒，我们表明这些颗粒上的可溶性污染物是导致HDM效应改变的有效成分。这项研究强调，环境暴露可能影响组织反应，这取决于存在的MNP细胞类型，在体外模拟这些事件时应考虑这些因素。了解不同免疫细胞类型对过敏原和污染物暴露的细微反应，也有助于更好地理解这些暴露如何影响人类疾病的发展和恶化。

‌局限性‌：体外模型不能完全模拟体内复杂的细胞互作和微环境。

‌未来方向‌：1.结合空间转录组学分析细胞定位与功能关系2.探索靶向特定MNP亚型治疗过敏性疾病的潜力3.研究其他环境污染物与过敏原的交互作用

参考文献：

Fransen LFH, Leonard MO. Mononuclear phagocyte sub-types in vitro display diverse transcriptional responses to dust mite exposure. Sci Rep. 2024 Jun 20;14(1):14187. doi: 10.1038/s41598-024-64783-1. PMID: 38902328; PMCID: PMC11189906.